Fractalkine受体缺失通过防止αE-catenin表达下调减少心梗后心脏破裂的发生

【摘要】背景与研究目的：心脏破裂是急性心肌梗塞的一种致死性并发症,占急性心梗患者院内病死率的10-20%。虽然成功的冠脉再灌注治疗可以有效的减少心肌梗塞的死亡率以及心肌梗塞再发,但溶栓治疗有可能增加早期心脏破裂的风险。因此,寻找一种有效的预防心梗后心脏破裂发生的方法具有重要的临床意义。近来大量研究明确指出心梗后的心肌炎症,细胞外基质损伤以及心梗后的心肌修复在心脏破裂的发生过程中有着极为重要的作用。因此,干预以上病理生理过程的治疗很有可能成为心梗后心脏破裂的重要治疗靶点。心梗后的炎症反应包括系统性炎症反应与心肌内炎症反应,适当地炎症反应是心梗后心肌修复与瘢痕形成所必需的,但是过度的炎症反应以及心肌细胞外基质的重塑则有可能导致一系列的不良后果,包括心脏破裂、心室重塑、心肌坏死等。心梗后炎症以一系列的炎症细胞如单核巨噬细胞以及中性粒细胞的浸润为特点的。有研究证明,发生心脏破裂的心梗患者心肌炎症程度要比非心脏破裂患者要高,心脏破裂的发生与炎症细胞尤其是巨噬细胞的浸润显著相关。这些是心梗后心脏破裂高发时间段梗死心肌中主要的浸润炎症细胞,在有破裂倾向的心脏中显著增多。而且,炎症浸润加重往往与促炎因子表达及产生增加、MMPs(MMP-2,MMP-8,MMP-9以及MMP-13)相关,提示了心梗后炎症与细胞外基质降解有关。Fractalkine(FKN,或者CX3CL1)是新近发现的一种膜结合型趋化因子,参与了一系列包括冠状动脉粥样硬化以及心肌梗塞等疾病的病理生理过程。FKN缺失的小鼠脑缺血再灌注损伤减轻,而CX3CR1(FKN受体)特异性敲除的小鼠冠脉事件的发生风险大大降低。ICAM-1参与炎症过程,而MMP-9则促进细胞外基质的降解,两者均可以影响到心脏破裂的发生率。我们已经发现了FKN可以上调心肌细胞细胞间粘附因子(ICAM-1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达,而白藜芦醇可以通过拮抗FKN的有害效应减少小鼠心梗后的心肌梗塞发生率以及总死亡率。因为心梗后1周内心梗小鼠的主要死亡原因为心脏破裂,因此我们不禁要考虑抑制FKN是否可以减少心脏破裂的发生。影响心脏破裂发生率的另外一个重要因素就是心肌的抗拉强度。纤维胶原形成三维网状结构,为心肌提供足够的抗拉强度,维持相邻的心肌细胞排列整齐。尽管无法定量检测,但在非致死性心脏破裂并接受急诊心脏手术的患者心脏发现心脏破裂部位周围的梗死心肌更加易碎,可以使用钝性手术钳轻易移除。而且,直接缝合心脏破裂孔后会有很高的再次破裂风险。这些发现提示梗死心肌的机械强度显著减弱。更早的一些研究检测并对比了包括兔、狗、羊在内的不同种属间梗死心肌抗拉强度的差异,最后发现其与正常心肌或非梗死区心肌并无显著差异。在大鼠梗死心脏中心梗后4天检测到的TTR值(tension-to-rupture,致破裂拉力)并无改变提示其抗拉强度得到了很好的维持。这些发现与这些种属的动物很少发生心脏破裂这一现象是一致的。相反,心梗小鼠的梗死心肌抗拉强度显著下降,更重要的是,小鼠梗死心肌抗拉强度的下降在心梗后24小时就可以检测得到,要早于心脏破裂发生的时间。在心脏破裂发生的高峰期(3-4天),梗死区心肌的抗拉强度大约下降60%左右。细胞间粘附连接蛋白aE-catenin是维持心肌抗拉强度的一种必需成员,有研究发现心脏破裂死亡的患者心肌闰盘区aE-catenin的表达下调且定位紊乱,提示了aE-catenin在防止心脏破裂发生上的重要作用。除此之外,有研究发现抑制Rho激酶(ROCK)可以增加E-cadherin与a-catenin的表达水平,并且刺激细胞间粘附连接的形成,而在我们此前的研究中发现FKN可以激活RhoA/ROCK通路,并且诱导细胞骨架重排,因此我们假设FKN可以通过激活RhoA/ROCK通路下调aE-catenin的表达从而促进了心脏破裂的发生。本研究我们重点研究以下内容：(i)引进CX3CR1敲除小鼠验证CX3CR1敲除后是否能够改善小鼠心梗后的存活以及减少心脏破裂的发生；(ii)通过检测ICAM-1,MPO,CD68,MMP-9,aE-catenin等因子分析CX3CR1敲除影响小鼠心梗后心脏破裂发生率的原因(iii)通过体外细胞实验分析RhoA/ROCK通路是否FKN下调aE-catenin表达水平的信号通路。研究方法：1、心肌梗塞动物模型的制作。CX3CR1-/-(CX3CR1基因敲除,KO)小鼠购自美国Jackson实验室,取10-12周龄雄性小鼠与同龄C57BL/6雄性小鼠,体重约22-25g,戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0尼龙线穿过左心耳下缘1-2mm处的2/3心肌层,结扎左侧冠状动脉,诱导心肌梗死。小鼠心电图监测CT段抬高典型且5分钟后未回落证明模型制作成功。心梗后1天、3天、7天后取材,用于蛋白或基因分析的小鼠心脏保存于-80℃,用于免疫组化的小鼠心脏则置于4%多聚甲醛中固定,心脏切片约4-6μm,包埋于石蜡。实验分4组：野生型假手术组,野生型心梗组,基因型假手术组,基因型心梗组。2、细胞培养。SD大鼠乳鼠细胞分离并予以相应刺激,除对照组PBS组之外分组如下：1)s-FKN组：s-FKN200ng/mL;2)s-FKN+Y27632组：s-FKN200ng/mL+Y2763210μmol/L;3)缺氧组；4)缺氧+s-FKN组；5)缺氧+s-FKN+Y27632组。刺激24小时后予以蛋白及基因水平的分析。3、PCR检测基因水平。细胞或组织的总RNA使用试剂盒提取(Omega,Norcross,GA).使用1μg总RNA进行逆转录。aE-catenin的基因水平检测使用RT-PCR,产物电泳后拍照进行半定量分析。MMP-9,ICAM-1的基因水平检测使用Real-timePCR(QuantitectSYBRGreen,TaKaRa).4、WesternBlotting检测蛋白水平。提取细胞与组织的总蛋白,BCA法定量后取同等量蛋白电泳,转膜后5%脱脂奶粉室温封闭2小时,4℃敷一抗：fractalkine(R&D,MAB571),aE-catenin(CellSignalingTechnology,#3236),以及P-actin抗体作为内参。5、免疫荧光。心肌细胞用4%多聚甲醛固定,以0.1%TritonX-100透膜,1%BSA封闭,敷一抗aE-catenin(1:1000)。然后以相应罗丹明荧光二抗孵育后用OlympusFluoviewFV1000共聚焦显微镜成像。6、免疫组化。心脏组织的石蜡切片抗原修复后4℃敷一抗aE-catenin、MPO与CD68过夜,然后孵育相应HRP二抗,苏木精染色显示细胞核,最后DAB显色。7、统计学分析。所有实验数据都以均数±标准差(x±s)表示,使用SPSS16.0统计分析软件行统计学分析,差异性检验水准均设为P<0.05(双侧)。1)计量资料两组间比较采用独立样本t检验,Levene方差齐性检验,方差不齐(P<0.05)条件下采用Satterthwaite近似t检验；2)心梗后小鼠的生存分析采用Kaplan-Meier生存分析；3)多组间比较采用析因设计资料的方差分析；4)多重比较采用Bonferroni(方差齐性)或Dunnett’sT3(方差不齐)。结果：1、小鼠心梗后心肌FKN表达水平升高。通过PCR检测小鼠心肌FKN基因水平,westernblot检测FKN蛋白水平,我们发现小鼠心梗后3天心肌FKN表达水平有统计学差异(基因水平方差齐性P=0.105,t=10.457,P<0.001；蛋白水平方差齐性P=0.443,t=3.654,P=0.022)。2.CX3CR1敲除小鼠心梗后心脏破裂发生率降低。引进FKN受体敲除基因小鼠(CX3CR1-/-)并与野生型小鼠同时制作小鼠心梗模型,通过心电图显示的心梗后ST段抬高程度间接反映两组小鼠心梗结扎程度接近。心梗后1周内生存曲线显示,24只野生型小鼠共死亡10只,死亡率41.7%,28只CX3CR1-/-小鼠中心梗后1周内仅死亡5只,死亡率17.9%,两组间有显著差异(x2=4.332,P=0.037)；24只野生型小鼠心梗后1周内9只发生心脏破裂,心脏破裂发生率37.5%,28只CX3CR1-/-、鼠中心梗后1周内3只发生心脏破裂,心脏破裂发生率10.7%,两组间有显著差异(x2=5.946,P=0.015)。3、FKN受体敲除小鼠心梗后心肌梗死面积减少。TTC染色后使用Image-J对染色后心脏横切片进行半定量分析,发现野生型小鼠心梗后梗死面积为53.78%±3.25%,而CX3CR1-/-小鼠心梗后的梗死面积为28.62%±1.77%,两组间有显著差异(方差齐性P=0.346,t=7.844,P<0.001)。4、心梗后炎症浸润以及细胞外基质降解在FKN受体敲除小鼠被部分抑制。通过Real-timePCR检测心肌ICAM-1表达水平,最后发现野生型小鼠组与受体敲除小鼠组的ICAM-1基础表达水平并无显著差异(方差齐性P=0.217,t=1.480,P=0.213),野生型小鼠心梗后ICAM-1表达水平较假手术组有显著差异(方差齐性P=0.180,t=12.079,P<0.001),受体敲除型小鼠心梗后ICAM-1表达水平较假手术组亦有显著差异(方差齐性P=0.334,t=3.901,P=0.018),比较野生型小鼠心梗后ICAM-1表达水平与受体敲除型小鼠心梗后表达水平有显著差异(方差齐性P=0.614,t=5.362,P=0.614)。通过析因设计资料的方差分析结果可以看到,总体效应中ICAM-1表达水平心梗较假手术有显著差异(F=106.094,P<0.001),受体敲除较野生型小鼠有显著差异(F=29.389,P=0.001),且提示存在交互效应(F=16.126,P=0.004)。通过免疫组化检测心肌MPO、CD68表达水平,最后发现野生型小鼠与基因型小鼠的MPO、CD68基础表达水平并无统计学差异,而心梗后野生型小鼠MPO、CD68表达水平较基础表达水平有统计学差异,而CX3CR1-/-小鼠的MPO、CD68表达水平则仅有轻度升高,比野生型小鼠的升高程度要小。通过Real-timePCR检测心肌MMP-9表达水平,最后发现野生型小鼠组与受体敲除小鼠组的MMP-9基础表达水平并无显著差异(方差不齐P=0.049,t=3.639,P=0.055),野生型小鼠心梗后MMP-9表达水平较假手术组有显著差异(方差齐性P=0.570,t=16.102,P<0.001),受体敲除型小鼠心梗后MMP-9表达水平较假手术组亦有显著差异(方差齐性P=0.080,t=6.297,P=0.003),比较野生型小鼠心梗后MMP-9表达水平与受体敲除型小鼠心梗后表达水平有显著差异(方差齐性P=0.550,t=7.181,P=0.002)。通过析因设计资料的方差分析结果可以看到,总体效应中MMP-9表达水平心梗较假手术有显著差异(F=230.085,P<0.001),受体敲除较野生型小鼠有显著差异(F=63.843,P<0.001),且提示存在交互效应(F=30.425,P=0.001)。5、心梗后αE-catenin的表达下调在FKN受体敲除小鼠被改善通过PCR检测心肌αE-catenin基因表达水平,对结果进行半定量分析,最后发现CX3CR1-/-小鼠的αE-catenin基础表达水平与野生型小鼠并无显著差异(CX3CR1-/-小鼠假手术组1.75±0.26vs.野生型小鼠假手术组1.76±0.25,方差齐性P=0.916,t=0.028,P=0.979)。野生型小鼠心梗后αE-catenin表达水平与基础表达水平有显著差异(方差齐性P=0.136,F=67.315,P<0.001),结合多重比较结果,梗死区αE-catenin表达水平0.36±0.01低于假手术组1.76±0.25(P<0.001),非梗死区0.67±0.11低于假手术组1.76±0.25(P<0.001),非梗死区与梗死区心肌αE-catenin表达水平并无显著差异(P=0.146).CX3CR1-/–小鼠心梗后αE-catenin表达水平与基础表达水平有显著差异(方差齐性P=0.777,F=8.412,P=0.018),结合多重比较结果,梗死区αE-catenin表达水平1.13±0.16低于假手术组1.75±0.26(P=0.031),非梗死区1.18±0.19低于假手术组1.75±0.26(P=0.043),梗死区与非梗死区的心肌αE-catenin表达水平并无显著差异(P=1.000)。心梗后CX3CR1-/-小鼠与野生型小鼠的对应区域αE-catenin表达水平相比均有显著差异,CX3CR1-/–小鼠梗死区1.13±0.16高于野生型小鼠梗死区0.36±0.01(方差不齐P=0.020,t=8.089,P=0.015),CX3CR1-/–小鼠非梗死区1.18±0.19高于野生型小鼠非梗死区0.67±0.11(方差不齐P=0.504,t=4.063,P=0.015)。通过析因设计资料的方差分析,总体效应CX3CR1-/-小鼠与野生型小鼠有显著差异(F=24.162,P<0.001),假手术与心梗后区域有显著差异(F=52.177,P<0.001),小鼠分型与处理方式之间的交互效应显著(F=6.997,P=0.010),相应的交互效应轮廓图也直观的反映了这一点。通过免疫组化检测心肌αE-catenin蛋白表达水平,发现CX3CR1-/-小鼠的αE-catenin基础表达水平与野生型小鼠并无显著差异,心梗后野生型小鼠αE-catenin表达水平显著下降,而在梗死区表达水平下降尤其显著,非梗死区心肌αE-catenin表达水平下降程度较梗死区轻；CX3CR1-/-小鼠梗死后αE-catenin表达水平下降,梗死区与非梗死区的心肌αE-catenin表达水平并无显著差异,且均较野生型小鼠的对应区域αE-catenin表达水平高。6、s-FKN或缺氧刺激导致的心肌细胞αE-catenin表达下调被ROCK1抑制剂Y27632改善。通过PCR检测心肌细胞αE-catenin基因表达水平,对结果进行半定量分析,最后发现心肌细胞在缺氧状态αE-catenin表达水平与常氧状态下有显著差异(F=112.463,P<0.001),这种差异在三种不同的处理方式下均存在,PBS处理缺氧组1.16±0.08低于常氧组1.38±0.05(方差齐性P=0.505,t=4.701,P=0.003),s-FKN刺激缺氧组0.68±0.04低于常氧组1.03±0.04(方差齐性P=0.490,t=11.864,P<0.001),FKN+Y27632刺激缺氧组1.02±0.07低于常氧组1.20±0.06(方差齐性P=660,t=4.022,P=0.007)。常氧状态下不同的处理方式之间有显著差异(方差齐性P=0.990,F=49.645,P<0.001),结合多重比较结果,FKN刺激组低于PBS组(P<0.001),FKN+Y27632刺激缺氧组高于FKN组(P=0.003)但低于PBS组(P=0.002)。缺氧状态下不同的处理方式之间有显著差异(方差齐性P=0.504,F=61.455,P<0.001),结合多重比较结果,FKN刺激组低于PBS组(P<0.001),FKN+Y27632刺激缺氧组高于FKN组(P<0.001)但低于PBS组(P=0.036)。通过析因设计资料的方差分析,总体效应缺氧状态与常氧状态有显著差异(F=112.463,P<0.001),三种不同的处理方式之间有显著差异(F=108.834,P<0.001),细胞状态与处理方式之间的交互效应显著(F=5.099,P=0.018),相应的交互效应轮廓图也直观的反映了这一点。通过免疫荧光检测心肌细胞αE-catenin蛋白表达水平,最后发现心肌细胞αE-catenin荧光强度在s-FKN刺激或者是缺氧时表达水平均显著减弱,与基因水平的变化一致,在s-FKN刺激的基础上加入了ROCK1抑制剂Y27632抑制RhoA/ROCK信号通路,结果发现加入Y27632后s-FKN刺激或缺氧导致的αE-catenin表达下调均得到了一定程度的改善。结论：1.心肌梗塞时,心肌FKN表达水平显著上调；2.FKN受体敲除小鼠心梗后一周心脏破裂发生率显著降低；3.FKN受体敲除小鼠心梗后心梗面积显著减少；4.FKN受体敲除小鼠心梗后的炎症浸润得到显著抑制；5.FKN受体敲除小鼠心梗后的细胞外基质降解得到显著抑制；6.FKN受体敲除小鼠心梗后αE-catenin的表达下调得到显著改善；7.FKN通过RhoA/ROCK通路下调αE-catenin的表达。
【作者】苏亮；
【导师】许顶立；廖禹林；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】心肌梗塞；心脏破裂；fractalkine；αE-catenin；RhoA/ROCK通路；

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